provocări în extragerea RNA

Ghid de depanare pentru extragerea totală a ARN-ului & Purificare

1. Ce cauzează degradarea ARN-ului?
2. Cum poate fi îmbunătățită extracția ARN?
3. De ce ARN-ul este mai greu de extras decât ADN-ul?
4. Cum puteți preveni contaminarea ADN-ului în timpul izolării ARN-ului?
5. Cum putem proteja ARN-ul de degradare?
6. Autoclavarea distruge ARN-ul?
7. Cum congelați celulele pentru extracția ARN-ului?
8. Cum scapi de ARN?
9. Cum funcționează extracția ARN?
10. De ce este utilizat azotul lichid în extracția ARN?
11. Care este scopul extracției ARN?
12. Ce este un randament bun de ARN?

Ce cauzează degradarea ARN-ului?

Există două motive principale pentru degradarea ARN în timpul analizei ARN. În primul rând, ARN-ul prin însăși structura sa este inerent mai slab decât ADN-ul. ... Acest lucru face ca ARN-ul să fie mai labil din punct de vedere chimic decât ADN-ul. ARN este, de asemenea, mai predispus la degradarea căldurii decât ADN-ul.

Cum poate fi îmbunătățită extracția ARN?

Există 3 metode eficiente pentru a realiza acest lucru:

1. Omogenizați bine probele imediat după recoltare într-o soluție de liză celulară pe bază de haotrop (de exemplu, conținând guanidinium), cum ar fi tamponul de liză disponibil în kitul Mini PureLink RNA sau în reactivul TRIzol.
2. Eșantioanele îngheață rapid în azot lichid.

De ce ARN-ul este mai greu de extras decât ADN-ul?

Principalul motiv este că ARN-ul este mai puțin stabil și mai ușor de degradat în comparație cu ADN-ul. ... ARN-ul are caneluri mai mari decât ADN-ul, ceea ce face mai ușor să fie atacat de enzime. Enzimele care degradează ARN, ribonucleaze (RNaze) sunt abundente în mediu și greu de îndepărtat complet.

Cum puteți preveni contaminarea ADN în timpul izolării ARN-ului?

Problema poate fi uneori evitată prin constrângerea primerilor să depășească limitele intronului, dar acest lucru este adesea dificil, iar metodele utilizate în prezent pentru a reduce contaminarea ADN includ digestia ADNseza I, fracționarea gelului, fenol acid: extracția cloroformului și precipitarea clorurii de litiu.

Cum putem proteja ARN-ul de degradare?

Pentru a preveni degradarea, probele de ARN sunt în general depozitate congelate la -20 ° C sau -80 ° C sau sub azot lichid.

Autoclavarea distruge ARN-ul?

Asigurați-vă că separați reactivii utilizați pentru lucrul cu ARN de "reactivi de uz general" din laborator. Toate soluțiile, cu excepția tampoanelor Tris, trebuie tratate cu 0,1% DEPC (sau DMPC) peste noapte la temperatura camerei și apoi autoclavizate. Autoclavarea hidrolizează și distruge DEPC și DMPC nereacționat.

Cum congelați celulele pentru extracția ARN?

Așezați țesutul într-un tub de microfugă de 1,5 ml sau conic de 15 ml și congelați rapid pe gheață uscată. Alternativ, înfășurați țesutul în folie de aluminiu și înghețați cu azot lichid.

Cum scapi de ARN?

Contaminarea cu ARN poate fi îndepărtată prin adăugarea a 2 microlitri de RNază A (10 mg / ml, Fermentas) la 20 microlitri de ADN dizolvat în tampon TE (Tris-EDTA, pH = 8,0) și incubare timp de 3-4 ore la 37 C.

Cum funcționează extracția ARN?

Metode de extracție organică

În timpul centrifugării, proba se separă în trei faze: o fază organică inferioară, o fază mijlocie care conține proteine ​​denaturate și ADNc și o fază apoasă superioară care conține ARN. Faza apoasă superioară este recuperată și ARN-ul este colectat prin precipitare de alcool și rehidratare.

De ce este utilizat azotul lichid în extracția ARN-ului?

Azotul lichid este utilizat deoarece are o temperatură foarte scăzută de -176 ° C, care ajută la pulverizarea substanței dure a țesutului vegetal și animal pentru a se transforma în praf. De asemenea, ajută la dezactivarea DNAazei pentru a digera ADN-ul .

Care este scopul extracției ARN?

Extracția ARN este purificarea ARN din probe biologice. Această procedură este complicată de prezența omniprezentă a enzimelor ribonucleaze în celule și țesuturi, care pot degrada rapid ARN-ul.

Ce este un randament bun de ARN?

Un A₂₆₀/A₂₈₀ un raport mai mare de 1,8 este considerat de obicei un indicator acceptabil al ARN-ului de bună calitate, cu un nivel scăzut de contaminare cu proteine ​​[14, 15]. Un A₂₆₀/A₂₃₀ un raport mai mare de 1,8 este utilizat ca indicator al ARN-ului extras cu un nivel scăzut de contaminare cu polizaharide.