Restricţie

problema restricționării cartografierii cu digestie dublă

problema restricționării cartografierii cu digestie dublă
  1. De ce există restricții de digestie dublă?
  2. De ce nu funcționează rezumatul meu de restricție?
  3. Ce se întâmplă dacă adăugați prea multă enzimă de restricție?
  4. Se pot tăia două enzime de restricție în același loc?
  5. Cum calculați rezumatul de restricție?
  6. Cât timp ar trebui să dureze un rezumat de restricție?
  7. Este necesară inactivarea termică a enzimelor de restricție?
  8. Expiră enzimele de restricție?
  9. Cum poate fi prevenită digestia de restricție?
  10. De ce nu ar tăia o enzimă de restricție?
  11. Cum selectați enzimele de restricție?
  12. De ce enzimele de restricție trebuie păstrate pe gheață?

De ce există restricții de digestie dublă?

Digerarea simultană a unui substrat ADN cu două endonucleaze de restricție (dublă digestie) este o procedură obișnuită de economisire a timpului. Alegerea celui mai bun NEBuffer pentru a oferi condiții de reacție care optimizează activitatea enzimei, precum și evită activitatea stelelor asociate cu unele enzime este un aspect important.

De ce nu funcționează rezumatul meu de restricție?

Digestie incompletă sau inexistentă din cauza activității enzimatice blocate de metilarea ADN-ului. Dacă enzima dvs. este activă și digeră ADN-ul de control, iar reacția este configurată în condiții optime, dar vedeți totuși probleme legate de digestie, s-ar putea datora faptului că enzima este inhibată de metilarea ADN-ului șablon.

Ce se întâmplă dacă adăugați prea multă enzimă de restricție?

Digestia incompletă poate apărea atunci când se folosește prea multă sau prea puțină enzimă. Prezența contaminanților în proba de ADN poate inhiba enzimele, rezultând, de asemenea, o digestie incompletă.

Se pot tăia două enzime de restricție în același loc?

Puteți face cu controale adecvate, cum ar fi digestia cu restricție unică și ambele enzime împreună, pentru a vă asigura că ambele se reduc independent și împreună și pentru a continua planurile. Din păcate, am fost limitat la aceste două enzime care se întâmplau să aibă site-uri una lângă alta!

Cum calculați rezumatul de restricție?

Calculați cantitatea din fiecare pe care trebuie să o adăugați la o digestie de restricție pentru a digera 5ug (5000ng) de ADN cu 5 unități de enzimă. De exemplu, dacă ADN-ul meu este la 190 ng / ul, aș avea nevoie de: 5000ng / 190ng / ul = 26 ul din proba mea.

Cât timp ar trebui să dureze un rezumat de restricție?

* Pro-Tip * În funcție de aplicație și de cantitatea de ADN din reacție, timpul de incubație poate varia de la 45 de minute până peste noapte. Pentru digestii diagnostice, 1-2 ore sunt adesea suficiente. Pentru digestii cu >1 µg de ADN utilizat pentru clonare, se recomandă să digerați cel puțin 4 ore.

Este necesară inactivarea termică a enzimelor de restricție?

Întrebări frecvente: Este necesară inactivarea enzimelor de restricție după digestia vectorială? Inactivarea endonucleazelor de restricție nu este în general necesară, dar în unele cazuri ar putea crește eficiența transformării.

Expiră enzimele de restricție?

Toate enzimele sunt testate pentru activitate la fiecare 3-6 luni; data de expirare este indicată pe eticheta atașată fiecărui flacon de enzimă. După treizeci și cinci de ani de experiență cu enzimele de restricție, am constatat că majoritatea sunt foarte stabile atunci când sunt depozitate la -20 ° C în tamponul de stocare recomandat.

Cum poate fi prevenită digestia de restricție?

Restriction Enzyme Digest Protocol

  1. Adăugați componente la un tub curat în ordinea prezentată: ...
  2. Incubați reacția la temperatura de digestie (de obicei 37 ° C) timp de 1 oră.
  3. Opriți digestia prin inactivarea căldurii (65 ° C timp de 15 minute) sau adăugarea unei concentrații finale 10mM EDTA.
  4. ADN-ul digerat este gata de utilizare în aplicații de cercetare.

De ce nu ar tăia o enzimă de restricție?

Întrebări frecvente: De ce enzima mea de restricție nu taie ADN-ul? ... Dacă ADN-ul de control este clivat și ADN-ul experimental rezistă la clivaj, cei doi ADN-uri pot fi amestecați pentru a determina dacă un inhibitor este prezent în proba experimentală. Dacă este prezent un inhibitor (adesea sare, EDTA sau fenol), ADN-ul de control nu se va tăia după amestecare.

Cum selectați enzimele de restricție?

Când selectați enzime de restricție, doriți să alegeți enzime care:

  1. Flancează-ți inserția, dar nu taie în interiorul inserției.
  2. Se află în locația dorită în plasmida destinatarului dvs. (de obicei în site-ul de clonare multiplă (MCS)), dar nu tăiați în altă parte pe plasmidă.

De ce enzimele de restricție trebuie păstrate pe gheață?

Chiar trebuie enzimele să fie păstrate pe gheață tot timpul? ... Enzimele trebuie depozitate și utilizate la temperaturile lor optime. Enzimele sunt depozitate în general în glicerol la -20 ° C. Acest lucru îi împiedică să înghețe complet, ceea ce determină denaturarea proteinelor și duce la pierderea activității.

fracția de hexan
Dar fracția de hexan este orice hidrocarbură care distilează la aproape aceeași temperatură ca n-hexanul. Aceasta înseamnă mai ales un amestec de alte...
Opțiunea de apelare vs. Opțiunea de vânzare
Cu o opțiune de vânzare, investitorul profită atunci când prețul acțiunilor scade. ... Atunci când cumpără o opțiune de achiziție, cumpărătorul trebui...
Care este diferența dintre țesut și sistemul de țesut
Principala diferență între țesut și sistemul țesut este că țesutul este o organizare a celulelor similare din punct de vedere structural și funcțional...