Cum se proiectează grundele pentru mutageneza dirijată pe site

Grundele trebuie să aibă o lungime cuprinsă între 25 și 45 de baze, cu o temperatură de topire (Tm) ≥78 ° C. Mutația dorită (ștergere sau inserție) ar trebui să fie în mijlocul primerului cu ~ 10-15 baze de secvență corectă pe ambele părți și conținut minim de GC de 40% și ar trebui să se termine într-una sau mai multe baze C sau G.

1. Cum proiectați un primer bun?
2. Cum faci mutageneză dirijată de site?
3. Cum se utilizează PCR pentru mutageneza direcționată pe site?
4. Cum faci un primer ADNc?
5. Cât de specific trebuie să fie primerii?
6. Cum proiectați manual un primer?
7. Care este scopul principal al mutagenezei direcționate la nivelul site-ului?
8. Cine a descoperit metoda mutagenezei dirijate de site?
9. Care fază este utilizată în mutageneza dirijată de oligonucleotide?
10. Cum funcționează mutageneza PCR?
11. Cum detectează mutația PCR?
12. Cum funcționează un PCR?

Cum proiectați un primer bun?

Luând în considerare informațiile de mai sus, primerii ar trebui să aibă, în general, următoarele proprietăți:

1. Lungimea de 18-24 de baze.
2. 40-60% conținut G / C.
3. Începeți și terminați cu 1-2 perechi G / C.
4. Temperatura de topire (Tm) de 50-60 ° C.
5. Perechile de grund ar trebui să aibă un Tm la 5 ° C unul de altul.
6. Perechile primare nu ar trebui să aibă regiuni complementare.

Cum faci mutageneză dirijată de site?

În această metodă, un fragment de ADN este sintetizat și apoi introdus într-o plasmidă. Acesta implică scindarea printr-o enzimă de restricție la un loc din plasmidă și ligarea ulterioară a unei perechi de oligonucleotide complementare care conțin mutația din gena de interes pentru plasmidă.

Cum se utilizează PCR pentru mutageneza direcționată la nivelul site-ului?

Atunci când PCR este utilizată pentru mutageneză direcționată către situs, primerii sunt proiectați pentru a include modificarea dorită, care ar putea fi substituirea bazei, adăugarea sau ștergerea (Figura 1). În timpul PCR, mutația este încorporată în amplicon, înlocuind secvența originală.

Cum faci un primer ADNc?

RT-PCR în doi pași:

1. Denaturați amestecul șablon-primer timp de 10 minute la + 65 ° C înainte de a adăuga transcriptază inversă.
2. Utilizați primeri hexameri aleatori sau primeri specifici genei.
3. Utilizați transcriptaze inverse care permit transcrierea inversă la temperaturi mai ridicate, cum ar fi Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit.

Cât de specific trebuie să fie primerii?

O lungime bună pentru primerii PCR este în general de aproximativ 18-30 de baze. Specificitatea depinde de obicei de lungimea și temperatura de recoacere. Cu cât primerii sunt mai scurți, cu atât mai eficient se vor lega sau se vor recoace de țintă.

Cum proiectați manual un primer?

Creați un primer din secvența dvs.

Deschideți o secvență ADN, accesați vizualizarea „Harta secvenței”, selectați o regiune și faceți clic dreapta. Din meniul derulant, selectați „Creați manual” și selectați direcția dorită. Va apărea o filă „Design Primer” care afișează alți parametri pentru a vă ajuta în proiectarea primerului.

Care este scopul principal al mutagenezei direcționate la nivelul locului?

Mutageneza dirijată la locul (SDM) este o metodă de a crea modificări specifice, direcționate, în ADN-ul plasmidic dublu catenar. Există multe motive pentru a face modificări specifice ADN-ului (inserții, ștergeri și substituții), inclusiv: Pentru a studia modificările activității proteinelor care apar ca urmare a manipulării ADN-ului.

Cine a descoperit metoda mutagenezei dirijate de site?

... crearea unei tehnici cunoscute sub numele de mutageneză direcționată către sit. În 1983, biochimistul american Kary B. Mullis a inventat reacția în lanț a polimerazei, o metodă pentru detectarea și amplificarea rapidă a unei secvențe ADN specifice fără a o clona..

Care fază este utilizată în mutageneză dirijată de oligonucleotide?

În protocolul GeneEditor, oligonucleotida de selecție este recoaptă la șablonul de ADN dublu catenar denaturat în același timp cu oligonucleotida mutagenă. Sinteza ulterioară și ligarea catenei mutante leagă cele două oligonucleotide.

Cum funcționează mutageneza PCR?

Mutageneza PCR este o metodă pentru generarea mutagenezei direcționate către sit. Această metodă poate genera mutații (substituții de bază, inserții și ștergeri) de la plasmida bicatenară fără a fi necesară subclonarea în vectori de bacteriofagi pe bază de M13 și pentru salvarea ssDNA.

Cum detectează mutația PCR?

PCR permite detectarea mutației, cu toate acestea, PCR în sine nu detectează mutația efectivă. PCR generează un amplicon care este apoi analizat printr-o altă metodă pentru a găsi posibile variații în interiorul ampliconului. ... Prin urmare, cantitatea de fluorescență emisă este direct proporțională cu cantitatea de amplicon.

Cum funcționează un PCR?

Cum funcționează PCR? Pentru a amplifica un segment de ADN utilizând PCR, proba este mai întâi încălzită astfel încât ADN-ul să se denatureze sau să se separe în două bucăți de ADN monocatenar. ... Pentru a amplifica un segment de ADN folosind PCR, proba este mai întâi încălzită astfel încât ADN-ul să se denatureze sau să se separe în două bucăți de ADN monocatenar.