depanare western blot

Rezolvați problemele western blot cu aceste sfaturi de depanare, care acoperă cauzele obișnuite de lipsă de semnal, fundal ridicat, benzi multiple și multe altele.

1. Fără semnal
2. Fundal ridicat.
3. Mai multe benzi.
4. „Pete” albe neuniforme pe pete.
5. Puncte negre pe pete.
6. Benzi albe pe o pată neagră.
7. Banda de marcare a greutății moleculare este neagră.

1. De ce nu funcționează Western blot-ul meu??
2. De ce este pata mea Western blot?
3. Ce cauzează legarea nespecifică în Western blot?
4. Te speli după blocarea Western blot?
5. Cum îmi pot îmbunătăți rezultatele western blot?
6. De ce folosim lapte în Western blot?
7. De ce există mai multe trupe în Western blot?
8. Care sunt etapele Western Blot?
9. Poți să transferi peste Western Blot?
10. Cum reduceți benzile nespecifice în Western blot?
11. Ce înseamnă trupele pe Western blot?
12. Cum preveniți degradarea proteinelor în Western blot?

De ce nu funcționează Western blot?

Depanarea unei pete (ca orice lucru din știință) trebuie să nu funcționeze metodic. ... De exemplu; concentrația de proteine ​​pe care o utilizați nu este suficientă, utilizați un tampon de probă greșit, ștergerea nu a mers bine, anticorpul pe care îl utilizați nu funcționează sau îl utilizați într-o concentrație greșită.

De ce este pata mea Western blot?

Nu ar putea exista o problemă cu gelul deoarece markerul are benzi intacte, poate ar putea exista o problemă cu proteina, ar fi putut fi degradată sau verificați cu orice probă pozitivă. ... Utilizați mai puține proteine ​​și / sau încercați o imunoprecipitare pentru a vă îmbogăți ținta în lizat. Diluați concentrația de anticorpi.

Ce cauzează legarea nespecifică în Western blot?

Una dintre cele mai frecvente cauze ale benzilor nespecifice este blocarea incompletă. Tampoanele de blocare sunt utilizate pentru a preveni legarea anticorpilor primari și secundari de membrană sau de orice altceva decât proteina de interes.

Te speli după blocarea Western blot?

Blocarea este un pas foarte important în faza de imunodetecție a Western blot, deoarece împiedică legarea nespecifică a anticorpului de membrana blotting. După blocare, pata este clătită în tampon de spălare, de obicei TBST, cu agitație ușoară și în volum suficient pentru a menține pata scufundată. ...

Cum îmi pot îmbunătăți rezultatele western blot?

Soluţie

1. Reduceți concentrația primară de anticorpi.
2. Reduceți cantitatea de proteine ​​totale încărcate pe gel.
3. Reglați condițiile de blocare a membranei.
4. Creșteți numărul de spălări.
5. Verificați specificitatea anticorpului.
6. Ștergeți numai cu anticorpul secundar.
7. Dacă se dezvoltă benzi, alegeți un anticorp secundar alternativ.

De ce folosim lapte în Western blot?

Blocarea este un pas foarte important al western blot, deoarece împiedică legarea anticorpilor de membrană nespecific. Blocarea se face adesea cu 5% BSA sau lapte uscat fără grăsime diluat în TBST pentru a reduce fundalul. ... Anticorpul poate fi diluat într-un tampon de spălare, cum ar fi PBS sau TBST.

De ce există mai multe trupe în Western blot?

Multiple benzi nespecifice pe blot se pot datora anticorpilor de calitate slabă sau la o concentrație prea mare, blocare insuficientă sau legare nespecifică din cauza prezenței SDS.

Care sunt etapele Western Blot?

Cinci pași sunt implicați în procedura Western Blotting și testul de detectare, și anume, transferul, blocarea, incubația primară a anticorpilor, incubarea secundară a anticorpilor și detectarea proteinelor și analiza Western Blot.

Poți să transferi peste Western Blot?

Cu creșterea timpului, există totuși un risc de supra-transfer (dezlipire, suflare) a proteinelor prin membrană, în special pentru greutatea moleculară mai mică (<30 kDa) proteine ​​atunci când se utilizează membrane cu o dimensiune mai mare a porilor (0,45 µm). Fluxul de lucru al electrotransferului umed / rezervor de proteine ​​pentru Western Blot.

Cum reduceți benzile nespecifice în Western blot?

Dacă aveți probleme cu legarea nespecifică, luați în considerare:

1. Creșterea timpului de expunere și / sau a temperaturii de blocare la care blocați.
2. Folosind o concentrație mai mare de proteine ​​în tampon.
3. Adăugarea 0,1% Tween la tampon.
4. Comparând cu un alt tampon de blocare complet.

Ce înseamnă trupele pe Western blot?

În primul rând, testul Western Blot măsoară anticorpii pe care corpul dvs. îi produce pentru a ataca infecția cu Lyme. ... La această rudă, trupa era o trupă de „amprentă”. ” Adică, Lyme este singurul organism care face corpul uman să producă acest anticorp.

Cum preveniți degradarea proteinelor în Western blot?

Cum să vă păstrați mostrele în Western Blot

1. Lucrează repede. Lucrul rapid poate reduce la minimum posibilele daune ale eșantioanelor, permițând pur și simplu mai puțin timp pentru ca acestea să se degradeze. ...
2. Păstrează totul la rece. Căldura este dușmanul proteinelor în soluție, deoarece proteazele sunt active la temperaturi mai calde. ...
3. Utilizați inhibitori de protează.